Možnosti využití analytické koncovky GC-MS/MS (QQQ) pro stanovení polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů a dibenzofuranů – porovnání s technikou GC-HRMS

Cíle studie

V tomto článku jsou shrnuty výsledky měření PCDD a PCDF, které bylo provedeno firmou ALS v laboratoři HRMS v Pardubicích. Toto pracoviště se věnuje problematice ultrastopových cílených analýz a zejména stanovení dioxinů a dalších persistentních organických polutantů téměř 20 let a má v oblasti bohaté zkušenosti. Laboratoř poskytuje svoje služby partnerům v mnoha odvětvích lidské činnosti. Je to zejména oblast životního prostředí, monitoring emisí a ovzduší a monitoring potravin a krmiv. Právě analýzy dioxinů v biotických matricích jako jsou potraviny a krmiva jsou nejnáročnějšími analýzami jak z hlediska nároků na zpracování vzorků, tak i z pohledu nároků na měřící techniku a její kondici při měření finálních extraktů těchto vzorků. 

Úvod & platná legislativa

Polychlorované dibenzo-p-dioxiny (PCDD) a dibenzofurany (PCDF), známé pod souhrnným názvem dioxiny, jsou vysoce toxické persistentní organické polutanty (POP), které vznikají jako vedlejší produkty průmyslových procesů jako je např. výroba chemikálií, pesticidů, bělení buničiny a papíru či během spalování odpadů. Přirozeným zdrojem dioxinů pak může být např. vulkanická činnost. Vzhledem k tomu, že se jedná o látky způsobující rakovinu či poruchy endokrinního a reprodukčního systému, byly tyto látky zařazeny v roce 2001 na seznam Stockholmské konvence s cílem redukovat jejich výskyt v životním prostředí. PCDD a PCDF jsou látky lipofilního charakteru se schopností akumulovat se v tukových tkáních zvířat. Dle odhadu pochází více než 80 % expozice člověka těmto látkám právě z potravin živočišného původu.^1,2 Z výše uvedených důvodů požaduje Evropská komise pravidelný monitoring všech potravin a krmiv živočišného původu uvedených na trh, ve kterých nesmí být překročeny předepsané maximální hladiny (maximum level, ML). V konečném důsledku umožňují tato nařízení z dlouhodobého hlediska efektivní snižování expozice člověka těmto látkám.²

Dle platné legislativy ve Spojených státech amerických a v Evropské Unii (EU) je pro analýzu PCDD a PCDF v potravinách a krmivech živočišného původu vyžadována kvantifikace a konfirmace těchto analytů metodou isotopového zřeďování s využitím plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrii s vysokým rozlišením (GC-HRMS). V EU je pak navíc od roku 2014, dle nařízení 709/2014 a 644/2017 (nahrazuje dříve platné nařízení 589/2014) povolen screening těchto látek také pomocí jiné hmotnostně spektrometrické či bioanalytické techniky, která má umožnit cenově dostupné testování velkého množství vzorků. Pro jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci výsledků je pak v EU povoleno navíc použití techniky plynové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (GC-MS/MS).³

V rámci testování vzorku na obsah dioxinů je zjišťována přítomnost sedmi PCDD a deseti PCDF. Kromě toho je ve vzorku dále dle platné legislativy stanovován obsah čtyř non-ortho polychlorovaných biphenylů (PCB) a osmi mono-ortho PCB (souhrnně označovaných jako dioxin-like PCB; dl-PCB). Všechny sledované analyty a jejich toxické ekvivalentní faktory (TEF) stanovené WHO jsou uvedeny v Tabulce 1. TEF slouží při výpočtu odhadu celkové toxicity směsi PCDD a PCDF a dl-PCB (tzv. toxický ekvivalent koncentrace, TEQ) a zohledňuje různou toxicitu jednotlivých kongenerů.^1,3

Tabulka 1. PCDD, PCDF a dl-PCB monitorované dle platné EU legislativy a jejich TEF

Vzhledem k tomu, že některé ze sledovaných PCDD, PCDF a dl-PCB vykazují vysokou toxicitu již při velmi malých množstvích je potřeba zajistit, aby použitá analytická koncovka splňovala mimo jiné následující kritéria:

• Nízké limity detekce, tj. detekovatelná množství musí být v řádu femtogramů (10^{– 15} g)
• Nízké limity kvantifikace, tj. umožňuje kvantifikaci sledovaných látek na hladině, která se rovná 1/5 ML
• Vysoká selektivita, tj. metoda má schopnost rozlišit cílové PCDD a PCDF od možných interferencí přítomných ve vzorku na mnohonásobně vyšších koncentracích a dokáže od sebe rozeznat jednotlivé kongenery lišící se od sebe rozdílnou toxicitou (např. <25 % peak to peak separace 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF)
• Vysoká přesnost (vyjádřena jako správnost a opakovatelnost), tj. poskytuje výsledek, co nejvíce se blížící skutečné hodnotě (hodnota změřená versus hodnota certifikovaná v certifikovaném referenčním materiálu)

U GC-MS metod je dále vyžadována např. kontrola výtěžnosti pomocí přidaných ¹³C₁₂ značených standardů. Pro konfirmační metody je potřeba použít všech sedmnáct značených PCDD a PCDF. Zjištěná výtěžnost se pak musí pohybovat v rozmezí 60 až 120 %. U screeningových metod je povoleno rozmezí 30 až 140 %.

Pro GC-MS/MS metody musí být navíc splněno následující:

• Monitoring minimálně dvou specifických prekurzorových iontů a z nich následně vznikajících produktových iontů pro každý analyt
• Maximální odchylka relativní intenzity daných hmotnostních přechodů od předpokládané hodnoty nesmí být větší než ±15 %
• Rozlišení každého kvadrupólu by mělo být jednotkové či vyšší, tak aby bylo od sebe možno odseparovat možné interference
• Musí být splněna další legislativní kritéria např. EN 16215:2012.

Použití tandemové hmotnostní spektrometrie pro stanovení obsahu dioxinů a dl-PCB představuje efektivní řešení analýzy těchto látek dle platné evropské legislativy. V porovnání s HRMS sektorového typu jsou MS/MS detektory typu trojitý kvadrupól (QQQ) cenově dostupnější a méně náročné na obsluhu, přičemž současně přináší kvalitu výsledků, která je plně srovnatelná s kvalitou dat z HRMS detektorů.^2,4 Laboratoř navíc může tyto přístroje použít i pro další rutinní analýzy, například stanovení pesticidů, PCB nebo polycyklických aromatických uhlovodíků (PAU).

Experimentální část & výsledky

V rámci testování byly porovnány výsledky získané z Agilent 7890 plynového chromatografu (GC) ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem Agilent 7010B vybaveným vysokoúčinným iontovým zdrojem (HES) a GC-HRMS typu magnetický sektor. V rámci jedné analýzy byly sledovány všechny výše uvedené tetra- až okta-CDD a CDF a tri- až hepta CB. Oba přístroje byly shodně vybaveny chromatografickou kolonou Rxi-5Sil-MS (60 m × 0,25 mm × 0,25 µm). V případě GC-MS/MS byly pro každý analyt monitorovány dva MRM přechody. Podmínky měření GC-MS/MS (QQQ) a GC-HRMS jsou shrnuty v Tabulce 2 a 3.

Tabulka 2. Podmínky GC-MS/MS (QQQ) měření.

Tabulka 3. Podmínky GC-HRMS měření.

Na GC-MS/MS (QQQ) byly v rámci experimentů analyzovány extrakty reálných vzorků, které byly zároveň změřeny na GC-HRMS. Byly vybrány takové extrakty, které umožnily porovnat citlivost, lineární rozsah, selektivitu a robustnost instrumentů – tedy vzorky zemin, emisí a potravin, obsahující nízké a vysoké koncentrace PCDD/F a vzorky obsahující interferenty (polychlorované difenylethery a neidentifikované interferenty, které rušily analýzu, případně snižovaly citlivost přístroje). Extrakce a přečištění těchto vzorků byly provedeny standardními postupy dle EPA 1613 a EN 1948.

Při zpracování výsledků byla pozornost zaměřena především na základní pracovní charakteristiky metod, bez jejichž splnění by analýza dioxinů a dl-PCB nebyla dle platné legislativy možná. Jedná se o následující:

• Citlivost (limit detekce, limit kvantifikace…)
• Selektivita
• Lineární rozsah
• Robustnost
• Kvantifikace.

Citlivost

Citlivost obou přístrojů byla testována na vzorcích s koncentrací analytů blížících se limitům detekce (LOD ≈ 25 fg/nástřik) a kvantifikace (LOQ ≈ 50 fg/nástřik). Příklady chromatogramů dokládajících citlivost vybraných PCDD/F a jejich ¹³C₁₂ značených analogů jsou na obrázcích 1 až 3.

V případě 2,3,7,8-TCDD (Obrázek 1) na koncentrační hladině v oblasti kolem LOQ je citlivost obou přístrojů téměř srovnatelná. U GC-HRMS je pozorovatelný o něco lepší poměr signálu k šumu (S/N).

V koncentrační oblasti mezi LOD a LOQ (pro GC-HRMS již oblast kolem LOD) je ukázán pík 1,2,3,7,8-PeCDD (Obrázek 2). I v tomto případě je z chromatogramu patrné, že citlivost obou přístrojů je srovnatelná. Nicméně u GC-MS/MS (QQQ) lze předpokládat, že poloviční odezva analytu by byla ještě pozorovatelná a na GC-HRMS už nikoliv.

Na Obrázku 3 je pak ukázán záznam 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD. U GC-MS/MS (QQQ) se jedná o oblast LOD a pík je ještě stále detekovatelný. Pro GC-HRMS už je tato koncentrace pod LOD a pík už není téměř odlišitelný od šumu. Z hlediska citlivosti testovaného GC-MS/MS (QQQ) je citlivost tetra- až okta-PCDD/F srovnatelná s GC-HRMS v optimálním stavu.

Obrázek 1:

A) GC-MS/MS (QQQ): 2,3,7,8-TCDD nativní (RT 19,986 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 19,951 min – obrázek dole) ve vzorku sedimentu; koncentrace nativního 2,3,7,8-TCDD v oblasti kolem LOQ

B) GC-HRMS: 2,3,7,8-TCDD nativní (RT 20,90 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 20,88 min – obrázek dole) ve vzorku sedimentu; koncentrace nativního 2,3,7,8-TCDD v oblasti kolem LOQ

Obrázek 2:

A) GC-MS/MS (QQQ): 1,2,3,7,8-PeCDD nativní (RT 26,290 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 26,288 min – obrázek dole) ve vzorku sedimentu; koncentrace nativního 1,2,3,7,8-PeCDD v oblasti mezi LOD a LOQ

B) GC-HRMS: 1,2,3,7,8-PeCDD nativní (RT 27,73 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 27,71 min – obrázek dole) ve vzorku sedimentu; koncentrace nativního 1,2,3,7,8-PeCDD v oblasti kolem LOD

Obrázek 3:

A) GC-MS/MS (QQQ): 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD nativní (RT 39,141 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 39,131 min – obrázek dole) ve vzorku sedimentu; koncentrace nativního 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD v oblasti LOD

B) GC-HRMS: 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD nativní (RT 39,92 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 39,85 min – obrázek dole) ve vzorku sedimentu; koncentrace nativního 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD v oblasti pod LOD

Selektivita

Vybrané chromatogramy představující schopnost selektivního měření obou testovaných přístrojů jsou ukázány na obrázcích 4 až 7. Schopnost odlišit cílové analyty od interferujících komponent extraktu je extrémně důležitou vlastností dané instrumentální techniky ovlivňující správnost finálního výsledku, a to především na ultrastopových koncentracích, na kterých se PCDD/F běžně vyskytují.

Na Obrázku 4 je ukázán pík odpovídající dl-PCB 126. V případě GC-HRMS můžeme v oblasti před daným píkem vidět interferenci, která navyšuje odezvu dl-PCB 126 na čtyřnásobek. Na GC-MS/MS (QQQ) není tato interference díky volbě dostatečně selektivního MRM přechodu vůbec pozorována.

Z Obrázku 5 je dále patrné, že v případě nativního okta-CDD lze na GC-HRMS pozorovat více šumu a větší množství neznámých interferencí (RT 42,17 min a 43,23 min). Tyto interference na GC-MS/MS (QQQ) zcela chybí. Nicméně i na QQQ lze pozorovat na daném MRM přechodu signál (RT 41,9 min), který nepřísluší danému cílovému analytu.

Obrázek 6 ukazuje další typ interference, která v tomto případě vzniká ve vzorku fragmentací přidaného ¹³C₁₂ značenéhohexa-PCB 153. Konkrétně se jedná o fragment vznikající odtržením jednoho atomu chlóru z molekuly s jedním značeným uhlíkem. Tento fragment na obou přístrojích interferuje na MRM přechodu/hmotě nativního penta-PCB 105 a hexa-PCB 153. Na GC-MS/MS (QQQ) je pozorovaný fragment 114× menší než PCB 153, zatímco na GC-HRMS pouze 37×. Na GC-MS/MS(QQQ) se tudíž daná interference projeví 3× méně.

Poslední obrázek týkající se interferencí (tj. Obrázek 7) představuje známou interferenci, a to heptachlorované difenylethery, které ruší signál na MRM přechodu/hmotě charakteristickém pro penta-CDF. Interference difenyletherů je v tomto případě totožná pro oba typy instrumentů. Tento výsledek odpovídá i teoretickému předpokladu, a to vzhledem k tomu, že fragment heptachlorovaných difenyletherů má totožné složení jako PeCDF.

Z pohledu selektivity lze říci, že na obou testovaných instrumentech lze vidět určité druhy interferencí, které se někdy navzájem liší a v určitých případech jsou shodné (např. interference chlorovaných difenyletherů). Ve většině případů lze však lepší selektivitu pozorovat na GC-MS/MS (QQQ).

Obrázek 4:

A) GC-MS/MS (QQQ): PCB 126 nativní (RT 20,331 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 20,313 min – obrázek dole) ve vzorku potraviny

B) GC-HRMS: PCB 126 nativní M+ a (M+2)+ ionty (RT 17,19 min – horní dva obrázky) a 13C12 značený (RT 17,19 min – obrázek dole) ve vzorku potraviny

Obrázek 5:

A) GC-MS/MS (QQQ): okta-CDD nativní (RT 42,302 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 42,284 – obrázek dole) ve vzorku potraviny

B) GC-HRMS: okta-CDD nativní (RT 43,12 min – obrázek nahoře) a 13C12 značený (RT 43,08 – obrázek dole) ve vzorku potraviny

Obrázek 6:

A) GC-MS/MS (QQQ): fragment z 13C12 značeného hexa-PCB 153 (M-Cl s jedním 13C12) interferující na MRM přechodu penta-PCB 105 (RT 18,181 min – obrázek nahoře) a hexa-PCB 153 (RT 18,187 – obrázek dole) ve vzorku potraviny

B) GC-HRMS: fragment z 13C12 značeného hexa-PCB 153 (M-Cl s jedním 13C12) interferující na hmotě penta-PCB 105 (RT 20,90 min – obrázek nahoře) a nativního hexa-PCB 153 (RT 20,90 min – obrázek dole) ve vzorku potraviny

Obrázek 7:

A) GC-MS/MS (QQQ): heptachlorované difenylethery interferující na MRM přechodu penta-CDF (RT 24,47 a 24,866 min) a 13C12 značený 1,2,3,7,8-PeCDF (RT 24,181 min) ve vzorku sedimentu

B) GC-HRMS: heptachlorované difenylethery interferující na hmotě penta-CDF (RT 25,82 a 26,23 min) a 13C12 značený 1,2,3,7,8-PeCDF (RT 25,53 min) ve vzorku sedimentu

Lineární rozsah

Linearita obou instrumentů byla testována na vzorku zeminy s velmi vysokou koncentrací cílového analytu hepta-CDF, kdy již dochází k deformaci jeho chromatografického píku, ale poměr odezev mezi nativním hepta-CDF a ¹³C₁₂ značeným standardem zůstává zachován, takže je možná jeho kvantifikace (viz Obrázek 8). V tomto případě byl poměr mezi odezvou nativního hepta-CDF a odezvou odpovídající LOD přibližně 1 400 000:1 pro oba instrumenty. Lze tak konstatovat, že koncentrační lineární rozsah obou instrumentů není menší než 6 řádů. Vyšší koncentrace již nebyla testována.

Obrázek 8:

A) GC-MS/MS (QQQ): hepta-CDF nativní (RT 37,723 min – obrázek nahoře) a ¹³C₁₂ značený (RT 37,688 min – obrázek dole).

B) GC-HRMS: hepta-CDF nativní (RT 40,45 min – obrázek nahoře) a ¹³C₁₂ značený (RT 40,42 min – obrázek dole)

Vliv vysoce koncentrovaných interferentů na citlivost instrumentu

Na jednom z asi dvaceti testovaných vzorků se na GC-MS/MS (QQQ) projevilo snížení signálu značeného ¹³C₁₂ HxCDD (viz Obrázek 9A). Toto bylo pravděpodobně způsobené vysoce koncentrovaným interferentem, který neposkytuje odezvu na MRM přechodu pro ¹³C₁₂ HxCDD, ale způsobil „zahlcení“ iontového zdroje, a tím snížení citlivosti pro daný analyt. Na GC-HRMS tento efekt nebyl pozorován (viz Obrázek 9B). V případě GC-MS/MS(QQQ) došlo ke snížení odezvy ¹³C₁₂ značeného 1,2,3,6,7,8-HxCDD asi 10×. Pro správné vyhodnocení by bylo nutné vzorek ještě jednou dodatečně přečistit.

Obrázek 9:

A) GC-MS/MS (QQQ): hexa-CDD nativní (pod LOD) a ¹³C₁₂ značené 1,2,3,4,7,8-HxCDD (RT 33,1 min), 1,2,3,6,7,8-HxCDD (RT 33,31 min) a 1,2,3,7,8,9-HxCDD (RT 33,88 min)

B) GC-HRMS: hexa-CDD nativní (pod LOD) a ¹³C₁₂ značené 1,2,3,4,7,8-HxCDD (RT 34,74 min), 1,2,3,6,7,8-HxCDD (RT 34,94 min) a 1,2,3,7,8,9-HxCDD (RT 35,51 min)

Kvantifikace

Na závěr všech experimentů byla provedena kvantifikace všech cílových analytů ve vzorku potraviny, konkrétně kraba, změřeném na GC-MS/MS (QQQ) a GC-HRMS. Jak je vidět z Tabulky 4, oba instrumenty poskytují shodné výsledky a výsledky splňují kritéria pro duplicitní analýzu.

Tabulka 4: Výsledky měření PCDD/F ve vzorku kraba.

Závěr

Pro testované instrumenty GC-MS/MS (QQQ, Agilent 7010B) a GC-HRMS bylo zjištěno následující:

• Oba instrumenty mají podobnou citlivost a lineární rozsah.
• GC-MS/MS (QQQ) vykazuje lepší selektivitu, ale větší vliv vysoce koncentrovaných interferentů na snížení citlivosti instrumentu. GC-MS/MS (QQQ) s větší úspěšností „odfiltroval“ odezvy většiny interferentů. Na druhou stranu, vysoce koncentrované interferenty mohou snížit citlivost GC-MS/MS (QQQ) s větší pravděpodobností než u GC-HRMS
• Na základě provedeného měření lze předpokládat, že u většiny vzorků budou oba instrumenty poskytovat shodné výsledky kvantifikace PCDD/F.

Studie prokázala využitelnost techniky GC-MS/MS (QQQ) pro stanovení dioxinů v rutinní praxi. Parametry metody jako jsou mez kvantifikace nebo lineární rozsah byly porovnatelné s „tradiční“ technikou GC-HRMS a jsou plně v souladu s platnými legislativními nároky na tento typ analýz.

Literatura:

1. Determination of polychlorinated dibenzo-z-dioxins (PCDD) and polychlorinated dibenzofurans (PCDF) in foodstuffs and animal feed using the Agilent 7000 triple quadrupole GC/MS system; Fűrst P., Baumeister D., Sandy Ch., Agilent Technologies, 2010, 5990-6594EN
2. Validation of a confirmatory GC/MS/MS method for dioxins and dioxin-like PCBs to meet the requirements of EU regulation 709/2014; Riener J., Agilent Technologies, 2016, 5991-6590EN
3. Commission regulation (EU) 2017/644 of 5 April 2017 laying down methods of sampling and analysis for the control of levels of dioxins, dioxin-like PCBs and non-dioxin-like PCBs in certain foodstuffs and repealing Regulation (EU) No 589/2014
4. Tetra- through octa-chlorinated dioxins and furans analysis in water by isotope dilution GC/MS/MS; Lin H., Bet J., Dunn J., Martin G., Somerville D., Wong D., Walker D., Marvin C., Agilent Technologies,2019, 5994-0677EN

Autor: Jaroslav Jurenka, ALS Czech Republic, s.r.o., Kamila Hanišová, HPST, s.r.o.